fitokim

Pendahuluan

Tanin: senyawa fenolik larut air dengan BM 500-3000, memberikan reaksi umum senyawa fenol, dan memiliki sifat-sifat khusus seperti presipitasi alkaloid, gelatin, dan protein-protein lain (Bate-Smith)

Haslam à mengganti polifenol dengan tanin, BM > 20.000 juga telah diketahui, dan tanin tidak hanya membentuk kompleks dengan alkaloid dan protein, tapi juga dengan polisakarida

Ø  Banyak terdistribusi dalam kingdom plantae à daun, buah, kulit batang, atau batang

Ø  Tanin ~ senyawa kompleks à biasanya campuran polifenol à tidak mengkristal (tannin extracts)

Ø  Tanin merupakan polimerasi polifenol sederhana

Ø  Kromatografi à identifikasi polifenol sederhana dalam ekstrak tanin

Manfaat

Pengkhelat ion logam, Presipitasi protein, Antioksidan biologis

True Tannins Vs Pseudo-Tannins

True tannins:  Molecular weights of 1000-5000.

Pseudo-tannins: Gallic acid, catechins and chlorogenic acid are similar phenolic compounds: have a low molecular weight.

Classification of Tannins

In higher plants, two groups of tannins are generally distinguished, which differ by their structure, as well as their biogenic origin – hydrolysable tannins and condensed tannins.

Hydrolysable Tannins:    Ellagitannins

                                                Gallotannins

Tannins - Properties

Water-soluble

Also soluble in dilute alkali, alcohol, glycerol and acetone

Slightly soluble in other organic solvents.

Solutions precipitate heavy metals, alkaloids, glycosides and gelatin.

Tannins - Properties

If a dilute ferric chloride solution is added to an aqueous extract of hamamelis leaves (containing both types of tannins), a blue colour is produced which then changes to orange-green as more ferric chloride is added.

Free gallic acid gives an orange colour with potassium iodate.

Tannin Properties:  Hydrolysable or Condensed?

With ferric salts, gallo-tannins and ellagi-tannins give blue-black precipitates.

Condensed tannins give brown-green precipitates. 

Condensed tannins turn red with vanillin and HCL.

Gallo-tannins give a pink colour with potassium iodate.

Ellagitannins react (are coloured) with nitrous acid in the presence of acetic acid.  Colour reaction:  pink à  purple  à  blue.

TLC is used to analyze extracts (visualized under UV light and with the reagents mentioned above)

HPLC can also be used.

Tanin terhidrolisiskan

Merupakan ikatan ester

Hidrolisis à asam fenolat + gula

Terdapat pada Dicotyledonae

Contoh:

                * galotanin = ester asam galat + glukosa

                * elagitanin = ester asam heksahidroksi                                                 difenat + glukosa

Identifikasi tanin terhidrolisiskan

Deteksi pendahuluan:

Ekstrak eter/etil asetat -Hidrolisis asam -Asam galat/asam elagat -KLT

KLT dua arah:

                fase diam: silika

                fase gerak: pengembang 1: benzena-asam asetat-air (6:7:3)

                                           pengembang 2: asam asetat 15 % dalam air

                deteksi: uv: bercak gelap

                                     dengan pereaksi Folin setelah diuapi amonia: biru

Ekstraksi skala besar: aseton-air

Komponen ester ekstrak kasar dipantau dengan kromatografi kertas dua arah

                fase gerak 1: BAW (14:1:5)

                fase gerak 2: asam asetat 6 %

HPLC

                fase diam: kolom RP-18 Li Chrosorb 10 mm

                fase gerak: gradien konsentrasi air (mengandung 0,05 % H₃PO₄) +                      asetonitril

                deteksi: penyemprot fenol umum

                tanin terhidrolisiskan dapat dibedakan dari tanin terkondensasi berdasarkan:

                                * Rf

                                * bercak fluorescensi ungu, diperkuat dengan uap NH₃

                                * semprot larutan jenuh KIO₃ à warna merah jambu

                tanin terkondensasi:

                                * dengan asam nitrit 10 % sedingin es yang ditambahi asam           asetat à warna merah menjadi biru indigo

               

Tanin terkondensasi

Disebut juga golongan proantosianidin

Kondensasi > dua molekul flavan-3-ol

Terdapat pada Spermatophyta, Gymnospermae, dan Angiospermae

Contoh:

                * protosianidin = oligomer katekin + flavan-                                             3,4-diol

Identifikasi tanin terkondensasi

Deteksi langsung dalam jaringan tumbuhan hijau:

Jaringan tumbuhan hijau >HCl mendidih, 30’>Warna merah >Ekstraksi amil/butil alkohol >KLT

Telaah lebih terinci:

Jaringan segar >Ekstraksi metanol 50-80 %>Ekstrak metanol >KLT dua arah

HPLC

                fase diam: kolom Li Chrosorb RP-8

                fase gerak: campuran air-metanol

                à ekstrak kasar harus dapat mengendapkan albumin serum sapi jika ditambahkan ke dalam larutan 5 % dalam air

Proantosianidin dapat dipisahkan dengan skala preparatif dengan kromatografi Sephadex

                Pemurnian pendahuluan: Sephadex G-50, fase gerak aseton-air (1:1) yang mengandung asam askorbat 0,1 %

                Pemurnian II: kolom Sephadex LH20 dalam metanol-air (1:1), proantosianidin diperoleh kembali dengan mengelusi air-aseton (7:3)

                à fraksinasi BM dengan G-50 atau G-100

Tannin Extraction

Tannins are extracted using water and acetone.

Optimal yields are obtained from fresh tissues or freeze-dried tissues.

Optimal yields are not obtained from dried tissues (tannins are irreversibly combined with other polymers)

After eliminating the acetone (distillation), the pigments and lipids are removed from the aqueous solution by a solvent extraction.

Ethyl acetate extraction of the aqueous solution separates the dimeric proanthrocyanidins and most gallotannins.

Polymeric proanthrocyanidins and high molecular weight gallotannins remain in the aqueous phase.

To obtain pure compounds, the appropriate chromatographic techniques are used (most often one of the gel filtrations)

Followed by reverse-phase chromatography (in water and alcohol, or water, alcohol and acetone mixures)

Ekstraksi tannin

Tumbuhan segar dikeringkan dengan freeze dry

Timbang dan serbuk dalam keadaan dingin dengan mortir

Tambahkan aseton 70 %

Sonifikasi 30’ 4⁰C

Sentrifuge dingin

Simpan supernatan

pada suhu 4⁰C

Identifikasi tanin total

Jaringan kering >Diserbuk halus >Ekstraksi 3X dengan metanol-air (1:1)(0,1 ml pelarut/mg) >Rotavapor > Ekstrak kental >Uji berdasar jenis tanin

1. Setara asam tanat (SAT)

                1 ml ekstrak + 1 ml darah segar à sentrifuge à absorbansi

                λ= 578 nm

                baku: asam tanat

2. Kadar proantosianidin

                ekstrak + n-butanol + HCl pekat 5 % à panaskan à absorbansi λ= 545 nm (sianidin) dan λ= 560 nm (delfinidin)

3. Kadar elagitanin

                0,5 ml ekstrak + 2,0 ml HNO₂ 0,1 M inkubasi 15’ dalam lingkungan N₂ à warna biru à absorbansi λ= 600 nm

4. Kadar galotanin

                0,5 ml ekstrak + 1,5 ml KIO₃ 12 % dalam metanol 33 % pada 15⁰C à absorbansi λ= 550 nm

LIGNAN

Pendahuluan

Lignan dan neolignan sering ditemukan sebagai turunan dimer fenil propanoid

Berhubungan dengan polimer lignin dan ditemukan di bagian tanaman yang berkayu

Terdapat dalam bentuk enantiomer tunggal, kadang bentuk rasemik

Neolignan dibentuk dari ikatan C-C rantai samping yang tidak simetris

Penamaan neolignan

                If the two C6C3 units (4) are linked by a bond other than a β,β'-bond the parent structure, neolignane, is used as the basis for naming the neolignan. The locants of the bond linking the two units are cited in front of the name and with the second number primed. Where there is a choice of locants, preference is made in the order:

(a) position 8

(b) lower unprimed numbers

(c) lower primed numbers

Aktivitas biologis

Lignan dan neolignan berperan penting dalam pertahanan tumbuhan sebagai:

1. Antimikroba
2. Antifungi
3. Antifeedant agent

Aktivitas farmakologi:

1. Antitumor
2. Antiviral

Biosintesis lignan

Asam ferulat >Reduksi>Koniferil alkohol >Dimerisasi oksidatif, Ikatan rantai samping C3 pada karbon b >Lignan

Contoh

Podophyllum

Ø  Terdiri dari akar dan rhizoma kering Podophyllum peltatum Linne (Fam Berberidaceae)

Ø  = mayapple = American mandrake

Ø  Mengandung 3,5-6 % resin dengan kandungan aktif lignan (podophyllotoxin 20 %, α-peltatin 10 %, dan b-peltatin

                5 %)

Ø  Konfigurasi cincin lakton bentuk trans (aktif) à basa lemah à bentuk cis (inaktif)

Ø  Kegunaan: antimitosis, purgative

Ø  Podophyllotoxin: fitoestrogen, anticancer

Contoh

Etoposide

v  Derivat semisintesis podophyllotoxin

v  Kegunaan: antineoplastik à inhibitor Topoisomerase II

                à digunakan sebagai kombinasi dengan obat-obat kemoterapi lain dalam pengobatan kanker

v  Perbedaan struktur dengan podophyllotoxin:

•          Glukosida etiliden pada posisi C1 à mengurangi toksisitas dibandingkan podophyllotoxin

•          Konfigurasi epimer pada posisi C4 cincin C

•          Gugus hidroksil pada posisi C4’ (bukan metoksi) à induksi pemecahan single strand DNA

Ekstraksi lignin

Serbuk halus kering tumbuhan >Ekstraksi dengan aseton atau etanol >Saring, tampung filtrat > +KOH pekat dalam air>Saring endapan >Ambil endapan sebagai garam kalium

Identifikasi lignan

Campuran sederhana lignan dapat dipisahkan dengan kromatografi kertas

                fase gerak: BAW & asam asetat 15 %

Campuran lebih rumit:

                1. kromatografi kertas

                    fase diam: kertas yang dibacem asam molibdat encer

                    fase gerak: butanol-asam asetat-asam molibdat dalam                                air

                2. KLT

                    fase diam: silika gel

                    fase gerak: etil asetat-metanol (9:1)

                                                 benzena-etanol (9:1)

                                                 kloroform-metanol (10:1) atau (25:1)    

Deteksi:

                kromatografi kertas:

                uv 254 nm bercak gelap

                penampak bercak antimon          klorida 10 % dalam CHCl₃

                KLT:

                uv 254 nm bercak gelap

                penampak bercak H₂SO₄ pekat dan MeOH à panaskan 100⁰C 10’ à abu-abu/ungu

HPLC:

                fase diam: kolom RP    C-18 Lichrosorb atau nucleosil

                fase gerak: campuran isokratis yang mengandung air dan MeOH

                pada beberapa kasus, gradien menggunakan campuran H2O / MeOH

FLAVONOID

-          KELOMPOK SENYAWA FENOL TERBESAR & TERSEBAR LUAS

-           BANYAKNYA JENIS DISEBABKAN BESARNYA VARIASI SUBSTITUEN

-           KERANGKA DASAR : TERDAPAT 15 ATOM C YG TERDIRI ATAS 2 CINCIN BENZENA (C6), DIHUBUNGKan   RANTAI PROPANA

-           

FLAVONOID MAYOR

-           FLAVON

-           FLAVONOL

-           ANTOSIANIN

FLAVONOID MINOR

-           KALKON (Compositae)

-           AURON (Compositae)

-           FLAVANON (Leguminosae, Iridaceae)

-           ISOFLAVON (Leguminosae)

VARIASI STRUKTUR DISEBABKAN TINGKAT HIDROKSILASI, ALKOKSILASI DAN GLIKOSILASI

GLIKOSIDA FLAVONOID

Flavonoid (Aglikon) + Gula  ®  Glikosida Flavonoid

a. FLAVONOID-O-GLIKOSIDA

  - Pd satu gugus hidroksil (atau lebih) terikat satu gula (atau lebih)

  - Glikosilasi menyebabkan flavonoid kurang reaktif & mudah larut air

  - Tdk tahan asam

  - Gula  ® umum : glukosa

                    sering : galaktosa, ramnosa, xilosa, arabinosa

                    jarang : alosa, manosa, fruktosa, apiosa

                    disakariada : glukosa-glukosa (soforosa, gentibiosa)

                                           ramnosa-glukosa (rutinosa, neohesperidosa)

b. FLAVONOID-C-GLIKOSIDA

  - Gula terikat pada atom C inti benzena

  - Tahan asam

  - Gula : Glukosa, Galaktosa, Ramnosa, Xilosa, Arabinosa

BIVLAVONOID

Flavonoid dimer (2 flavonoid)

-           Flavonoid yg terlibat biasanya flavon & flavanon

-           Ikatan yg terlibat :

                * ikatan C-C        : Agastiflavon (ikatan -6,8’’’)

                                                  Kupresuflavon (ikatan -8,8’’’)

                                                  Amentoflavon (ikatan -3’,8’’)

                                                  Robustaflavon (ikatan -6,4’’’)

                * ikatan eter      : Hinokiflavon (-6,4’’’)

                                                  Oknaflavon (3’,4’’’)

CIRI-CIRI STRUKTUR FLAVONOID

-           CINCIN A MEMILIKI POLA OKSIGENASI YG SELANG SELING

-           CINCIN B MEMBPUNYAI

                * SATU GUGUS FUNGSI OKSIGEN PADA POSISI PARA

                * DUA GUGUS FUNGSI OKSIGEN PADA POSISI PARA & META

                * TIGA GUGUS FUNGSI OKSIGEN PD POSISI 1 PARA & 2 META (JARANG)

                * OKSIGENASI PADA POSISI ORTO (JARANG)

SIFAT FLAVONOID

AGLIKON FLAVONOID : POLIFENOL

                * AGAK ASAM

                * POLAR, KRN ADA GUGUS HIDROKSIL DAN GULA

                * LARUT DLM MeOH, EtOH, BuOH, DMSO

                * BENTUK GLIKOSIDA LEBIH MUDAH LARUT DALAM AIR

                * AGLIKON YG KURANG POLAR SPT ISOFLOAVON,

                  FLAVANON, FLAVON DAN FLAVONOL YG TERMETOKSILASI

                 LARUT DALAM ETER & CHCl₃

BIOSINTESIS FLAVONOID

-          CINCIN A BERASAL DARI KONDENSASI 3 UNIT ASETAT-MALONAT

-           CINCIN B & C BERASAL DARI JALUR SIKIMAT

-           JADI FLAVONOID DIHASILKAN DARI KOMBINASI JALUR ASETAT-

  MALONAT DAN JALUR SIKIMAT

-           AKIBAT PERUBAHAN OLEH ENZIM, RANTAI PROPAN DAPAT

  MENGHASILKAN BERBAGAI GUGUS FUNGSI SEPERTI : IKATAN

  RANGKAP, GUGUS HIDROKSIL, GUGUS KARBONIL

ISOLASI DAN CARA ANALISIS

1.       KROMATOGRAFI KERTAS

                FASE DIAM  : KERTAS WHATMAN

                FASE GERAK : BAA, TBA

                DETEKSI    : UAP NH3, UV 366 nm

PEREAKSI SEMPROT PADA KKt

1. AlCl₃ 5%

                5-hidroksi flavonoid sebagai noda berfluoresensi kuning

                (dibawah UV 366 nm)

2.       Kompleks Difenil-Asam borat-Etanolamin 1% dlm MeOH

                3’,4’-dihidroksi flavon 3’,4’-dihidroksi flavonol : noda jingga pada UV/Vis

                4’-hidroksiflavon, 4’-hidroksiflavonol: noda hijau kekuningan     

3.                 Asam Sulfanilat yg terdiazotasi

                I. Asam sulfanilat 0,3% dalam HCl 8% (25 ml)            Noda kuning, jingga

                   + NaNO₂ 5% (1,5 ml)                                                    sampai merah

                II. Na₂CO₃

4. Vanilin HCl

                Vanilin 5% dalam EtOH + HCl pekat (4:1) ® Noda merah lembayung

                - Pada Katekin & Proantosianidin  ® segera tampak setelah dikeringkan

                - Pada Flavanon & Dihidroflavonol  ® lebih lambat

2.  KROMATOGRAFI KOLOM

     FASE DIAM :

* SELULOSE

                - UNTUK MEMISAHKAN GLIKOSIDA-GLIKOSIDA

                -              __ ,, __    GLIKOSIDA-AGLIKON

                -              __ ,, __    AGLIKON YG KURANG POLAR

*SILIKA

                - UNTUK MEMISAHKAN AGLIKON YG KURANG POLA  SPT ISOFLAVON, FLAVANON, METILFLAVON, FLAVONOL

* POLIAMID

   -  SEMUA FLAVONOID

* SEPHADEX (G)

   -  UNTUK MEMISAHKAN CAMPURAN POLIGLIKOSIDA BERDASARKAN

      UKURAN MOLEKUL.

   -  G-10 (BM<700 span="">

      G-25 (BM 100-1500)

   -  ELUEN : AIR

* SEPHADEX (LH20)

   -  UNTUK PEMURNIAN AKHIR AGLIKON FLAVONOID DAN GLIKOSIDA

      YG TELAH DIISOLASI DARI KKt, SILIKA ATAU POLIAMIDA

   -  ELUEN : MeOH

3. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

•  UNTUK MENCARI PELARUT SEBELUM DILAKUKAN  KROMATOGRAFI  KOLOM

•  ANALIS FRAKSI
•  ISOLASI FLAVONOID MURNI SKALA KECIL

ANALISIS STRUKTUR FLAVONOID

1.       SPEKTROKOPI UV VIS

-          DIGUNAKAN UNTUK MEMBANTU MENGIDENTIFIKASI JENIS FLAVONOID DAN  MENENTUKAN POLA OKSIGENASI

-           KEDUDUKAN GUGUS HIDROKSIL FENOL BEBAS PD INTI FLAVONOID DPT DITENTUKAN  DG MENAMBAHKAN PEREAKSI GESER KE DLM LARUTAN SAMPEL KEMUDIAN  MENGAMATI PERGESERAN PUNCAK SERAPAN (lmax)

-           KEUNTUNGAN CARA INI, JML FLAVONOID UNTUK ANALISIS RELATIF SEDIKIT (0,1 mg)

SPEKTRUM FLAVONOID

-          DITENTUKAN DLM LARUTAN MeOH

-           SPEKTRUM KHAS, TERDAPAT 2 l_{max :}

     * PITA I (DISEBABKAN CINCIN B)

     * PITA II (DISEBABKAN CINCIN A)

Keanekaragaman l_max  bergantung pada pola hidroksilasi dan pada derajat substitusi gugus OH:

•           Substitusi cincin A ® pita II

  Substitusi cincin B  ® pita I

•           Hidroksilasi menyebabkan pergeseran batokromik (bergeser ke l yang lebih tinggi)

                * 3,5,7,4’-OH flavon                        ® 367 nm

                * 3,5,7,4’,3’-OH flavon                  ® 370 nm

                * 3,5,7,4’,3’,5’-OH flavon              ® 374 nm

•           Metilasi/glikosilasi (terutama 3,5,7,4’ –OH) menyebabkan

  pergeseran hipsokromik (bergeser ke l yang lebih rendah)

•           Asetilasi menghilangkan pengaruh OH fenol pada spektrum

•           Asil ® 320 nm

•           Pada flavon & flavonol, 3’,4’-diOH dibuktikan dg adanya puncak ke-2 pada pita II

l_max FLAVONOID DAPAT BERUBAH (BATOKROMIK/HIPSOKROMIK)KRN PENAMBAHAN PEREAKSI GESER

PEREAKSI GESER

•          NaOMe

  2,5 g NaOMe/100 ml MeOH

  Dapat diganti NaOH 2M

•           NaOAc serbuk anhidrat

•           AlCl₃

  5 g AlCl3/100 ml MeOH

•           HCl

  50 ml HCl pekat/100 ml Aquades

•           H₃BO₃ serbuk anhidrat

TAHAP KEDUA PEREAKSI GESER

1. REKAM SPEKTRUM LARUTAN FLAVONOID DLM MeOH

     + 3 TETES NaOMe REKAM SPEKTRUM ± 5 MENIT, CUCI

2.       LARUTAN FLAVONOID DLM MeOH

     + 6 TETES AlCl3 REKAM SPEKTRUM

     + 3 TETES HCl REKAM SPEKTRUM, CUCI

3. LARUTAN FLAVONOID DLM MeOH

     + NaOAc (2 mm), KOCOK, REKAM SPEKTRUM

     + H₃BO₃ (½ NaOAc), REKAM SPEKTRUM

PENAFSIRAN SPEKTRUM

1.       TENTUKAN JENIS FLAVONOID DG MEMPERHATIKAN

                a. BENTUK UMUM SPEKTRUM “MeOH”

                b. PANJANG GELOMBANG PITA SERAPAN

                c. DATA KROMATOGRAFI KERTAS (lihat MARKHAM)

2.  PENAFSIRAN PERUBAHAN SPEKTRUM YG DISEBABKAN  PENAMBAHAN PEREAKSI GESER

-          Flavonoid + AlCl₃

 *  membentuk kompleks tak tahan asam antara o-diOH

 *  membentuk kompleks tahan asam antara ggs keton & hidroksil  

-          Flavonoid + AlCl₃ + HCl

  * kompleks tahan asam antara ggs keton & hidroksil tetap

  * kompleks tak  tahan asam antara o-diOH terurai kembali

Efek Flavonoid pada Berbagai Sel

-          Beberapa flavonoid mempengaruhi  kontraktilitas otot polos, contoh  phloretin melawan kontraksi bronchus manusia yang dirangsang prostaglandin

-           Polyphloretin menghambat pelepasan histamin yang diinduksi antigen pada jaringan paru

-           Beberapa flavonoid menunjukkan aktivitas melawan kontraksi otot polos babi yang dirangsang histamin, asetilkolin dan PGE₂.

-           Efek spasmolitik ekstrak metanol Psidium guajava L disumbang oleh quercetin, suatu flavonoid

EFEK PADA SARAF

·         Quercetin efektif menghambat pelepasan acetylcholin dan kontraksi otot polos

       Otak memiliki reseptor benzodiazepin, yang dapat mengikat biflavonoid amentoflavon

       Chrysin (5,7-dihydroxy flavon) juga dapat terikat  pada reseptor benzodiazepin dan memiliki efek anxiolitik

      Acacetin dan Luteolin yang diberikan secara oral mencegah implantasi telur yang sudah dibuahi pada mencit putih Wistar. Anti fertilitas ini perlu diteliti lebih lanjut

       Isoflavon ganistein (protein kedelai) memiliki efek anti esterogen, digunakansecara khusus pada wanita yang memiliki resiko tinggi terhadap kanker buah dada  ® menjelaskan,  wanita Jepang dan China jarang terkena kanker payudara karena  asupan kedelai yang tinggi

AKTIVITAS ANTI VIRUS

      Quercetin, morin, rutin, taxifolin, dihydrofisetin, leucocyanidin, pelargonidin, apigenin, catechin, hesperidin dan naringin dilaporkan memiliki aktivitas melawan 11 macam virus

       Quercetin, naringin dan catechin mengurangi infeksi dan replikasi HSV-1, virus polio type 1, virus para influenza type 3, Respiratory Syncytial Virus.

       4’-hydroxy-3-methoxyflavon memiliki aktivitas melawan virus rhino dan poliomyelitis. Potensi antiviral yang tinggi dikaitkan dengan gugus 4’-hydroxyl dan 3-methoxy

Efek Antitoxic, Hepatoprotective dan Cytoprotective

      Symalarin dan Silybin dihemisuccinat efektif sebagi hepatoprotektif terhadap CCl₄

       Silymarin juga melindungi dari lipid peroxidasi dan hemolysis pada erytrosit tikus yang diinduksi phenylhidrazin

       Lesi pada lambung tikus akibat pemberian alkohol secara oral dapat dicegah dengan pemberian quercetin secara parenteral

Aksi yang Berhubungan dengan Coronary Artery Disease (CAD) dan gangguan Pembuluh darah

      Peningkatan LDL, khususnya LDL teroksidasi merupakan faktor penyebab CAD

       Flavonoid tertentu (Fisetin, Morin, Quercetin) menghambat modifikasi (oksidasi) LDL oleh makrofag

       Beberapa glikosida flavonoid dilaporkan memilki aktivitas vasodilator

       Pemberian flavon dapat memperbaiki perfusi jantung kelinci setelah serangan ischemia