ALKALOID FITOKIMIA

Fakta tentang Alkaloid

Menyumbang banyak kegunaan dlm dunia medis dan sediaan farmasetik

Aktivitas biologis yg sangat luas

Sumbernya tersebar luas :tanaman, fungi, bakteri, amfibi, serangga, hewan laut

Secara biosintesis berasal dari asam amino yg berbeda shg menghasilkan struktur dasar yg berbeda

ALKALOID BERDASARKAN BIOGENESIS

A. Alkaloid heterosiklis yang berasal dari asam amino:

1. Ornithin
2. Lysin
3. Tirosin
4. Fenilalanin
5. Triptofan
6. Asam antranilat
7. Asam nikotinat
8. Histidin

B. Alkaloid heterosiklis yang berasal dari nukleotid purin

C. Alkaloid yang terbentuk melalui transaminasi: terpenoid alkaloid

D. Alkaloid yang terbentuk melalui transaminasi dimana N atom terletak pada eksosiklis

Struktur Alkaloid  Berdasarkan kedudukan atom N :

1. N 1’ atau punya gugus amin primer misalnya meskaline
2. N 2’ atau amin sekunder misal koniin
3. N 3’ atau amin tersier misal atropine
4. N 4’ atau amin kuarterner misal tubocurarine
5. Alkaloid Amida (netral)
6. Alkaloid fenolik

Pengaruh thd prosedur ekstraksi dan pemurnian

Kebasaan

Tergantung pada keberadaan lone pair elektron dari atom N, tipe heterosiklis dan substitusinya

Electron withdrawing group yang dekat dengan atom N menurunkan kebasaan

Elektron donating group menaikkan kebasaan

Struktur Alkaloid Berdasarkan struktur kimianya alkaloid di bagi 2 kelompok besar:

1. Alkaloid Non Heterosiklis / protoalkaloid/ amin biologi Contoh : Hordenin, meskalin, Efedrin, Colchisin.

2. Alkaloid Heterosiklis dibagi menjadi 12 kelompok menurut bentuk cincinnya.

1. Pyridine group: piperine, coniine, trigonelline, arecaidine, guvacine, pilocarpine, cytisine, nicotine, sparteine, pelletierine.
2. Pyrrolidine group: hygrine, cuscohygrine, nicotine
3. Tropane group: atropine, cocaine, ecgonine, scopolamine
4. Quinoline group: quinine, quinidine, dihydroquinine, dihydroquinidine, strychnine, brucine, veratrine, cevadine
5. Isoquinoline group: The opium alkaloids (morphine, codeine, thebaine, papaverine, narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine)
6. Aporphine group:Boldine
7. Indole group:

Tryptamines: DMT, NMT, psilocybin, serotonin

Ergolines: the ergot alkaloids (ergine, ergotamine, lysergic acid, etc.)

Beta-carbolines: harmine, yohimbine, reserpine, emetine

8.       Purine group: Xanthines: caffeine, theobromine, theophylline

9.       Terpenoid group:

Aconite alkaloids: aconitine

Steroids: solanine, samandarin

10.    Pyrrolizidine group : Symphitine,echimidine, senecionine,seneciphylline

11.    Norlupinane group: Sparteine,cytisine, lupanine,laburnine

12.    Imidazole group:pilocarpine

Biosintesis Alkaloid

Perunutan dg isotop radioaktif sejak 1954: senyawa antara dan mekanisme reaksi

Sebagian besar ciri jalur metabolisme: adanya pembentukan basa Schiff antara gugus amino primer dan aldehida.

Masalah utama: mengenali titik percabangan pd jalur metabolisme tempat terbentuknya senyawa antara  yg mengarah pd pembentukan alkaloid (bukan senyawa lainnya)

Manfaat mempelajari jalur biosintesis: bisa memproduksi alkaloid utk tujuan komersial melalui kultur sel mikroorganisme (bakteri rekombinan) atau tanaman

Biosintesis Alkaloid

1.       Dekarboksilasi dan transaminasi asam amino

2.       Menghasilkan aldehid yg dpt membentuk Schiff base

3.       Schiff base bereaksi dg Carbanion melalui kondensasi Mannich membentuk Alkaloid

                                                                               

Extraction of Alkaloids

Extraction is based on the basicity of alkaloids and on the fact that they normally occur in plants as salts (i.e.:  on the solubility of bases and salts in water and organic solvents).

Herbs often contain other materials which can interfere with extraction such as large amounts of fat, waxes, terpenes, pigments and other lipophilic substances (e.g by forming emulsions) – avoided by defatting the crushed herb (using petroleum ether and hexane)

Ekstraksi Alkaloid

1.       Karena keanekaragaman struktur alkaloid maka tidak ada metode tunggal dlm ekstraksi alkaloid

2.       Pertama Campuran Alkaloid di ekstraksi dari senyawa-senyawa non alkaloid

3.       Selanjutnya alkaloid dipisahkan dari campurannya

Pemisahan alkaloid

Metode umum untuk ekstraksi alkaloid

1.   Alkaloid diekstraksi sebagai garam

Bahan diekstraksi dg pelarut organik larut air ( etanol,metanol)  yg diasamkan (HCl 1M,asam asetat 10%,asam sitrat 5%, asam tartarat 2%), yg melarutkan alkaloid sebagai garam. Pigmen dan senyawa tak larut lainnya dipisahkan dgn menambahkan pelarut non polar spt kloroform.

Fasa asam diperlakukan dg penambahan basa misal ammonium hidroksida shg bentuk garam menjadi free alkaloid yg akan terekstrak oleh pelarut organik

               

2. Alkaloid diekstraksi sebagai basa bebas

Bahan dibasakan dg natrium karbonat atau lainnya, alkaloid basa bebas dilarutkan dg pelarut organik spt kloroform, eter,etil asetat.

Larutan kloroform yg mengandung basa bebas lalu diekstraksi dgn asam encer mis HCl 2 M,alkaloid akan pindah dr fase organik ke fase berair sbg garam klorida

Isolasi Alkaloid

Campuran alkaloid kompleks hasil ekstraksi tersebut dipisahkan dan dimurnikan dengan:

1.       Pengendapan dgn pelarut  atau reagen yg berbeda

2.       Kristalisasi

3.       Kromatografi (kolom, kertas, KLT, penukar ion)

4.       Destilasi utk alkaloid yg menguap

5.       Elusidasi Struktur dgn IR, MS, NMR

Contoh ekstraksi Piperin dari Piper nigrum

Serbuk merica diekstraksi dgn etanol 95% dalam alat soklet (sistem panas, 2 jam, 6-8 sirkulasi). Di saring, filtrat dipekatkan.

Ekstrak pekat ditambahkan KOH-etanolik (10%) sambil diaduk shg timbul endapan. Setelah mengendap, pisahkan sari dan endapan. Sari jernih didiamkan dalam lemari es sampai terbentuk kristal.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN ALKALOID DARI DAUN Gendarussa vulgaris Nees

1.       Dilakukan ekstraksi bertahap serbuk daun Gendarussa vulgaris Nees. dengan n-heksana lalu etanol 60%

2.       Dilanjutkan dengan penambahan HCl 2 N (pH 3 – 4), dipartisi dengan kloroform, sehingga didapatkan fraksi kloroform I (senyawa non alkaloid) dan fraksi air.

3.       Fraksi air ditambah NH4OH 25% (pH 9 - 10), kemudian dipartisi lagi dengan kloroform, didapatkan fraksi kloroform II, untuk mendapatkan ekstrak kasar alkaloid

4.       Dari serbuk daun sebanyak 4,67 kg didapatkan fraksi kloroform II sebanyak 0,9 gram.

5.       Untuk pemisahan alkaloid dari fraksi kloroform digunakan kromatografi cair kilat dengan fase gerak diklorometana : aseton, didapatkan fraksi A (10,8 mg) dan fraksi B (170,3 mg).

6.       fraksi B dilakukan pemisahan lebih lanjut dengan kromatografi cair kilat menggunakan fase gerak diklorometan : aseton, karena belum didapatkan satu noda

7.       fraksi A, dilakukan uji KLT dengan 3 macam kombinasi fase gerak, menunjukkan satu noda yang kemudian disebut dengan isolat A.

Gendarussa vulgaris Nees. merupakan tanaman obat tradisional yang termasuk dalam famili Acanthaceae. Berdasarkan etnomedisin, Gendarussa vulgaris Nees. digunakan masyarakat pedalaman Papua untuk kontrasepsi pria

—  Isolation of Alkaloids

All methods of alkaloid extraction yield impure compounds, so alkaloids therefore have to be separated.

TLC and HPLC are most commonly used.

Under the best conditions, alkaloids can be obtained by direct crystallization:  simply by neutralizing the acidic extraction medium.

                                               

Kristalisasi langsung. Pelarut yg sering digunakan adl metanol,etanol berair, metanol-kloroform,metanol- eter,metanol -aseton, etanol aseton. Contoh Isolasi Piperin

—  Isolation of Alkaloids

Large-scale extractions may be sent to a factory for purification & separation (for cinchona and cocoa alkaloids).

Separation and final purification may be done using fractional precipitation or fractional crystallization of salts.

Chromatograpy is used for complex alkaloids and if only small amounts of alkaloids are needed.

Volatile liquid alkaloids (nicotine) are isolated by distillation – alkaloid is distilled off in steam.  Nicotine is an important insecticide, and large amounts are prepared from the parts of the tobacco plant which is not used for tobacco manufacture

Alkaloid yang tidak mengandung oksigen dalam struktur kimianya biasanya pada suhu kamar bersifat cair (nikotin, koniin, spartein)

Alkaloid yang mengandung oksigen akan berbentuk kristal, umumnya kristal tidak berwarna, pada kasus tertentu berwarna (berberine), beberapa berupa amorph

—  Isolasi alkaloid

Alkaloid bisa diendapkan dg prx Mayer, lalu endapan dipisahkan mjd komponen-komponenya dengan cara kromatografi pertukaran ion.

Untuk memisahkan campuran alkaloid bisa digunakan kromatografi kolom memakai damar penukar ion.

Kromatografi penukar ion

—  Pemisahan senyawa polar berukuran kecil terutama bahan alam ionik

—  Teknik ini terbatas hanya untuk utk bahan alam yang gugus fungsionalnya bermuatan

—  Prinsip: penyerap atau fase diam memiliki gugus bermuatan dan ion –lawan gerak yang dapat menukar ion pd gugus fungsional bahan alam seiring mengalirnya fase gerak melewati penyerap

—  Pemisahan terjadi karena perbedaan afinitas antara komponen ionik (bahan alam polar) dan fase diam

—  Penyerap penukar ion atau resin dibagi 2 kelompok:

1.       Penukar kation, yg memiliki gugus asam (CO2H, -SO3H) dan mampu menukar proton mereka dgn kation dari bahan alam

2.       Penukar  anion, yg memiliki gugus basa (-N+R3) yg dimasukkan ke resin dan dpt menukarkan anionnya dgn anion dr bahan alam

—  Resin penukar ion dpt digunakan dlm kromatografi kolom terbuka atau kolom tertutup spt HPLC

Isolasi Dihidroksi metil-3,4-dihidroksipirolodin (DMDP)

—  Dari tumbuhan Lonchocarpus sericeus (Leguminosae)

—  Alkaloid terpolihidroksi yg bersifat  nematosid

—  Senyawa bersifat basa dan membentuk kation dalam larutan asam

—  Jika dimasukkan dlm penukar kation (mis. Amberlite CG-120, memiliki asam sulfonat, terikat pd resin yg dpt menukar protonnya/kation), kation DMDP ditahan oleh penukar kation shg proton berpindah

—  Jika penukar kation dieluasi dgn larutan yg mengandung kation yg lebih kuat spt NH4⁺  (NH4OH o,2M), kation DMDP akan di desorpsi dr penukar tersebut dan lepas serta berpindah

—  Afinitas ini dpt digunakan utk memisahkan alkaloid tersebut dr komponen asam (anion) atau netral yg tdk akan ditahan oleh penukar kation dan akan terbilas dr resin oleh air.

Untuk isolasi alkaloid dlm jumlah  skala mg dipakai gabungan kromatografi kolom memakai alumina dan kromatografi kertas.

Alkaloid campuran jg bisa dipisahkan berdasarkan kebasaan dan kepolaran menggunakan ekstraksi berturut-turut dr larutan dapar yg pH-nya dinaikkan sdkt demi sdkt.

—  PEMURNIAN ALKALOID

Fraksi pertama ini mgdg alkoid netral atau yg bersifat basa lemah.Lalu pH larutan berair dinaikkan dg bilangan 0,5,sp pH mencapai 9,0,setiap pH diekstrak dg pelarut organik.Perbedaan pH memungkinkan pemisahan scr bertahap alkaloid basa lemah & alkaloid basa kuat.Alkaloid basa kuat diekstraksi terakhir.

Isolasi alkaloid

—  KLT merupakan cara cepat untuk pemisahan alkaloid;fase diam silika gel G dg 8 sistem pengembang yg berlainan.

—  KCKT untuk analisis alkaloid

—  Alkaloid kuarterner yg sukar dipisahkan dg metode lain,dpt dipisahkan dg memakai kolom fase balik dg adanya kalium iodida.

 
Pereaksi warna:

1. Erdman: asam sulfat dengan sesepora asam nitrat
2. Froehd: asam sulfat yang mengandung asam molibdat atau amonium molibdat
3. Marqui:asam sulfat mengandung formaldehid
4. Mandelin: asam sulfat yang mengandung asam vanadat atau amonium vanadat

Positif palsu dengan komponen seperti senyawa pahit dan glikosida

·         KLT:

Silika gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa

Pada basa kuat, silikagel yang bersifat asam lemah dapat mengikat alkaloid (pada fase gerak netral)

TLC: UV, Dragendorff (+NaNO₂)

•          Alkaloid dengan amina primer dan sekunder negatif palsu

•          Kumarin, hidroksiflavon, triterpen dan kardenolida ttt positif palsu

Alkaloid purin: mureksid (Kalium perklorat + setetes HCl, diuapkan, ditambah amoniak = ungu)

Alkaloid morphin: reagen Marquis (H₂SO₄ + setetes formaldehida = ungu)

Identifikasi alkaloid

—  Setelah pemurnian bisa ditambahkan prx yg digunakan untuk penapisan alkaloid. Paling banyak digunakan prx Mayer krn bisa memberikan endapan pd banyak alkaloid

—  Alkaloid dg gugus fungsi khas bisa ditentukan dg prx khusus,misal morfin bersifat fenol bisa dideteksi dg prx fenol

—  Dg cara kromatografi dan spektrofotometri

—  Dg kromatografi kertas bisa didasarkan pd kepolaran

—  Untuk mendeteksi alkaloid pd kromatogram biasa dipakai prx Dragendorff, yg juga brx dg beberapa nonalkaloid

—  Bisa jg digunakan fluoresamina, tetra sianokuinondimetana, yg bereaksi secara berlainan dengan jenis struktur yg berbeda

—  Utk identifikasi lengkap digunakan cara kromatografi (Kertas,KLT,KGC,KCKT)& spektrofotometri (UV,IM,SM,RMI).

—  Jika alkaloid dlm tanaman sdh ditentukan bs di bandingkan dg senyawa standar.

—  Contoh identifikasi alkaloid dlm tembakau dg KLT digunakan silika gel dg eluen MeOH-CHCL₃ (3:17).Penampak bercak prx Dragendorf.Lalu dibandingkan dg senyawa pembanding.

—  Pharmacological Action & Uses

CNS Action:  stimulants (caffeine) or depressants (morphine)

ANS:  sympathomimetics (ephedrine) or sympatholytics (yohimbine, ergot alkaloids), parasympathomimetics (pilocarpine), anticholinergics (choline), ganglioplegics (nicotine).

Also:  local anesthetics (cocaine), defibrillation (quinidine), anti-tumour agents (ellipticine), anti-malarial (quinine), anti-bacterials (berberine), and amoebicides (emetine).

These actions lead to the extensive use of alkaloid containing herbs and drugs.

Although some are used as galenicals (belladonna, datura, and henbane), most are used as starting materials for industrial extraction (morphine from poppy straw or opium, and quinine from Cinchona bark.

Isolasi Alkaloid dr jambu Keling

—  Daun tumbuhan jambu Keling (Eugenia cumini (L.) Druce) didestruksi basah dengan HCl dalam metanol sebesar 2M kemudian dinetralisasi dengan penambahan basa NH4OH dan terjadi padatan berupa endapan. Endapan dikeringkan dan diektraksi dan direndam dalam khloroform dan dipekatkan dengan alat rota-evaporator.

—  Ekstrak pekat khloroform (2 g) dikhromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 sebanyak 60 gram dengan fasa gerak khloroform: metanol dengan menaikkan kepolaran bertingkat.

—  Fraksi yang keluar kolom khromatografi ditampung menggunakan vial serta dimonitor dengan khromatografi lapis tipis.

—  Fraksi dengan Rf yang sama dan positip dengan pereaksi Maeyer  yang  ditandai dengan munculnya warna putih, digabung, lalu diuapkan pelarutnya kemudian fraksi ini direkristalisasi untuk memperoleh kristal murni.

—  Kristal hasil isolasi dilakukan analisis Spektroskopi IR, 1H- NMR dan 13C- NMR dan penentuan titik leleh untuk menentukan senyawa hasil isolasi

Contoh Isolasi dgn KLT Preparatif (Isolasi Alkaloid dr Herba Comprey)

—  Herba diekstraksi dgn etanol 95% selama 3x24 jam. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat evaporator hingga diperoleh ekstrak yang kental

—  ditambah dengan HCI 2 N dan disaring. Filtrat hasil penambahan HCI kemudian ditambah dengan ammonia sampai pH 9, kemudian dilakukan ekstraksi cair-cair dengan pelarut diklormetan

—  Ekstrak diklormetan di kromatografi kolom dgn pengembang kloroform:metanol (1:1), diperoleh 21 fraksi

—  Fraksi-fraksi tersebut dipantau dgn KLT. Fraksi dgn Rf sama digabung. Didapatkan 2 Fraksi

—  Kedua fraksi tersebut dilakukan isolasi dgn KLT Preparatif secara terpisah dgn eluen kloroform-metanol (1:1) dan diperoleh beberapa pita.

—  Untuk mengetahui pita yang positif mengandung alkaloid,dilakukan penyemprotan dengan penampak bercak Dragendorff pada pinggir pelat. Pita yang positif alkaloid dikerok dan dilarutkan dalam metanol kemudian disaring.

—  Filtrat yang diperoleh kemudian diperiksa dengan kromatografi lapis tipis menggunakan pengembang kloroform-metanol (1:1). Bercak yang diperoleh diamati dibawah sinar UV pada 366 nm.

—  Pemurnian isolat dilakukan dengan menggunakan kromatografi dua dimensi dengan pengembang pertama kloroform-metanol (1: 1) dan pengembang kedua n-heksankloroform (3:2). Bercak tunggal yang diperoleh diamati dibawah sinar UV

—  Identifikasi Isolat dgn Spektrofotometri UV dan IR