EKSTRAKSI

PENGANTAR

Asal kata:

•          Phytochemistry ® phyto = tumbuhan chemistry = ilmu kimia

•          Phytochemical ® phyto = tumbuhan chemical = senyawa kimia

Definisi:

Phytochemistry is :

•          The study of the chemistry of substances found in plants (about.com chemistry).

•          The branch of chemistry concerned with plants and plant products (oxforddictionaries.com)

•          The biochemical study of plants; concerned with the identification, biosynthesis, and metabolism of chemical constituents of plants; especially used in regard to natural products (drugs.com).

•          Phytochemistry is in the strict sense of the word the study of phytochemicals. These are chemicals derived from plants.

•          In a narrower sense the terms are often used to describe the large number of secondary metabolic compounds found in plants.

Definisi:

•          Senyawa organik yang dibentuk & ditimbun oleh tumbuhan, meliputi :

Struktur kimianya, Biosintesisnya, Perubahan serta metabolismenya, Penyebarannya secara alamiah, Fungsi biologi

Hubungan fitokimia dengan ilmu lain

Phytochemistry’ or ‘Chemistry of Natural Products’ concern with:

•       Natural distribution.

•       Chemical structure,

•       Biosynthesis structure,

•       Biosyntheses (or biogenesis),

•       Metabolism, and Biochemical function.

Penggolongan senyawa(fitokimia)

Golongan senyawa :

•          Alkaloid

•          Terpenoid

•          Fenol  : polifenol, tanin, lignan

•          Flavonoid

Role of Phytochemicals

The importance of natural drug substances:

1. Serve as extremely useful natural drugs.
2. Provide basic compounds affording less toxic and more effective drug molecules.
3. Exploration of biologically active prototypes towards newer and better synthetic drugs.
4. Modification of inactive natural products by suitable biological/chemical means into potent drugs.

Peranan Fitokimia

•          Fisiologi Tumbuhan

Penentuan struktur, asal-usul biosintesis, kerja hormon tumbuhan

•          Patologi Tumbuhan

Penentuan sifat kimia fitotoksin & fitoaleksin

•          Sistematika Tumbuhan

Hibrida disiplin ilmu kimia & taksonomi ® Kemotaksonomi

EKSTRAKSI

Definisi

•          Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair

Penyiapan bahan baku

Pembuatan simplisia

•          Identifikasi bahan ® otentikasi

•          Pencucian

•          Sortasi basah

•          Pengeringan

•          Sortasi kering

•          Penyimpanan

Penyiapan bahan baku

•          Reduksi ukuran partikel simplisia

–         Penggilingan (grinding)

–         Pengayakan (sieving)

•          Ukuran partikel kecil

–         Makin banyak jumlah partikel yang kontak dengan pelarut ® makin efisien proses ekstraksi

Pemilihan pelarut

•          Mampu melarutkan & memisahkan zat yang akan diambil dari kandungan lain dalam bahan awal

•          Mudah penanganannya

•          Ekonomis

•          Tidak berbahaya bagi lingkungan dan aman

Pemilihan pelarut

Jenis pelarut :

•          Air

•          Alkohol (etanol, metanol, isopropanol)

•          Keton (aseton)

•          Asam karboksilat (asam asetat)

•          Kloro hidrokarbon (diklorometana, triklorometana)

•          Ester (etil asetat)

•          Eter (dietil eter)

•          Hidrokarbon alifatis (eter minyak bumi, n-heksana)

•          Minyak

Metode ekstraksi

•          Ekstraksi dingin

–         Maserasi

–         Perkolasi

•          Ekstraksi panas

–         Infusa & dekokta

–         Reflux

–         Soxhlet

–         Destilasi : air, uap

•          Ekstraksi dipercepat (accelerated)

–         Ultrasonikasi (ultrasound)

–         Gelombang mikro (microwave)

–         Ekstraksi superkritik (SFE)

Maserasi

•          Macere = merendam

•          Prinsip : pencapaian keseimbangan konsentrasi

•          Remaserasi ® pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan filtrasi maserat pertama

•          Maserasi kinetik ® pengadukan kontinu

•          Digesti ® maserasi kinetik pada suhu yg lebih tinggi dari suhu kamar (40-50^o C)

Perkolasi

•          Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi

•          Prinsip : ekstraksi sempurna (exhaustive)

•          Tahapan :

–         Pengembangan

–         Maserasi antara

–         Perkolasi sebenarnya

   

Infusa & Dekokta

•          Infusa adalah sediaan cair yang dibuat dengan mengekstraksi simplisia nabati dengan air pada suhu 90^oC selama 15 menit.

•          Literatur lain ® infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infusa tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98^oC) selama waktu tertentu (15-20 menit)

•          Dekokta ® waktu lebih lama (30’)

Refluks

•       Ekstraksi dengan pelarut pada suhu titik didihnya selama waktu tertentu & jumlah pelarut yg relatif konstan dg adanya pendingin balik

•       Umumnya dilakukan pengulangan proses pada   residu pertama sampai 3-5 kali   

Soxhlet

•          ekstraksi menggunakan pelarut yg selalu baru, yg umumnya dilakukan dengan alat khusus (soxhlet) sehingga terjadi ekstraksi berkesinambungan dgn jumlah pelarut relatif konstan dgn adanya pendingin balik

•          Umumnya digunakan thimble selulosa u/ senyawa organik

Destilasi

•          Destilasi air : bahan terendam seluruhnya atau sebagian dalam air yg mendidih

•          Destilasi uap ® bahan tidak terendam dalam air yg mendidih, tetapi dilewati uap air

•          Ekstraksi minyak atsiri

Ekstraksi Ultrasonik

•          Getaran ultrasonik (> 20.000 Hz)

•          Prinsip: meningkatkan permeabilitas dinding sel, menimbulkan gelembung spontan (cavitation) sebagai stres dinamika serta menimbulkan fraksi inter fase

Ekstraksi Superkritik

•          Ekstraksi menggunakan gas CO₂

•          Prinsip: perubahan variabel tekanan & temperatur ® kondisi polaritas tertentu yg sesuai untuk melarutkan golongan  senyawa kandungan tertentu

Ekstraksi gelombang mikro

•          Ekstraksi gelombang mikro (300Mhz-300GHz) ® energi panas langsung

•          Waktu ekstraksi < soxhlet

Pemekatan

•          Rotavapor

•          Freeze dryer

Evaluasi ekstrak

•          Parameter standar ekstrak

•          MC

•          Kandungan senyawa aktif ® profil kromatografi

A. Metode Ekstraksi

•          Pemilihan tumbuhan

–         Otentikasi tumbuhan (WHO, 1998; 2011)

•          Pembuatan simplisia

–         Persyaratan simplisia (Depkes, 1985)

•          Pemilihan metode ekstraksi

–         Ekstraksi dingin

–         Ekstraksi panas

–         Ekstraksi kinetik

–         Persyaratan ekstrak (Depkes, 2000)

B. Metode Pemisahan/Separasi

•          Teknik umum:

–         Sentrifugasi

–         Pembentukan garam

–         Kromatografi kolom

•          Teknik kromatografi ® purifikasi

–         Kromatografi Kertas (KKt)

–         Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

–         Kromatografi Gas Cair (KGC)

–         Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

•          KKt (PC) ® kandungan yg mudah larut air, misalnya karbohidrat, asam amino, basa asam nukleat, asam organik, senyawa fenolat

•          KLT (TLC) ® steroid, karotenoid, kuinon sederhana, klorofil

•          KGC (GLC) ® senyawa yang bersifat atsiri (mudah menguap)

•          KCKT (HPLC) ® senyawa yang sifat keatsiriannya kecil

C. Metode Identifikasi

•          Setelah isolasi & pemurnian

•          Penentuan golongan senyawa:

–         Uji warna

–         Penentuan kelarutan

–         Bilangan Rf

–         Ciri spektrum UV

C. Metode Identifikasi

Saran umum:

•          Senyawa yg pernah diketahui ® bandingkan dgn senyawa autentik/standar

•          Senyawa autentik tidak ada ® bandingkan dgn data pustaka

•          Senyawa baru ® penguraian kimia atau dgn mensintesis senyawa

•          Senyawa berbentuk kristal dan jumlahnya cukup ® kristalografi sinar-X

C. Metode Identifikasi

•       Identifikasi senyawa ® spektrum senyawa:

-          Spektrum UV

-          Spektrum Inframerah (IM/IR)

-          Spektrum Resonansi Magnetik Inti (RMI/NMR)

-          Spektrum Massa (SM/MS)

•       Pengukuran ciri lain :

-          Titik leleh, titik didih  

-          putaran optik

-          Rf atau RRt

SKRINING FITOKIMIA

•          Test/uji untuk mengetahui kandungan suatu simplisia (sebelumnya blm diketahui apa kandungannya).

•          Tujuan utama untuk mendapatkan kandungan bioaktif atau yang berguna untuk pengobatan

*

SYARAT METODE YANG DIPILIH

1. Sederhana
2. Cepat
3. Peralatan minimal
4. Selektif terhadap golongan senyawa yang dipelajari
5. LOD rendah
6. Dpt memberi keterangan tambahan ada tidaknya senyawa spesifik yang dipelajari

Uji kualitatif ini bisa dgn uji tabung atau secara KLT atau dapat digabungkan

Pembuatan Serbuk Simpleks

Pengumpulan bahan simpleks (seluruh tumbuhan atau bagian tumbuhan) dr daerah tertentu,bulan tertentu,dr tumbuhan tertentu,dicuci,dikeringkan dg cepat (diangin2kan,dipanaskan dl almari pemanas yg dilengkapi kipas angin,dijemur dibawah sinar matahari langsung,atau ditutupi kain hitam).

                Lalu dihancurkan ,digiling atau dihaluskan dg cara tertentu,diayak dan serbuk simpleks siap diteliti.

•           

UJI ALKALOID

Reagensia Alkaloid :

1. Golongan 1 : reagen yang dengan alkaloid ttt membentuk garam yg tidak larut misal asam siliko tungstat,asam fosfomolibdat,asam fosfotungstat.
2. Golongan 2 : reagen yg dg alkaloid ttt membentuk senyawa kompleks bebas, lalu m`bentuk endapan misal reagen Bouchardat, Wagner
3. Golongan 3 : reagen yg dg alkaloid m`btk senyawa adisi yg tdk larut misal reagen Mayer, Dragendorff, Marme.
4. Golongan 4 : reagen yg dg alkaloid ttt m`btk ikatan asam organik misal reagen Hager.

Cara pengujian

•          Serbuk (2 g)  + HCl 1% (10 ml) dipanaskan dlm tabung reaksi besar 30’ dlm tangas air mendidih.

•          Suspensi disaring dgn kapas dibagi dalam tabung A & tabung B sama banyak.

•          A dibagi 2, A-1 +pereaksi Dragendorff (3 tts),A-2+px Mayer (3 tts)-----adanya endapan berarti ada alkaloid

•          B +NaHCO₃ ad pH 8-9 dicampur kloroform(4 ml),aduk pelan2, sth kloroform memisah ambil dg pipet + asam cuka 5% ad pH 5, diaduk,ambil lapisan atas +px Dragendorff (5 tts)---adanya endapan berarti ada alkaloid dari basa kuarterner

•          Lapisan bawah + HCl 1% (10 tts).aduk ambil lap.atas + px Dragendorff (2 tts),adanya endapan berarti ada alkaloid dari basa tertier.

•          Perx utk pengendapan alkaloid yg lain: Bouchardat,Hager,Marme, Wagner,Asam siliko tungstat,Valser,Ecolle,Kraut,dll

•          Krn sensitivitas berbeda2 disimpulkan tdpt alkaloid bila + thdp 2 prx.Ideal + 4-5 prx.

Metode Culvernor-Fitzgerald

•          Dpt dilakukan di lapangan

•          Sederhana dan cepat

•          Cara: Gerus 2-4 g material tumbuhan dlm mortir,+kloroform +pasir bersih,digerus,+ 10 ml kloroform amoniakal,saring masukkan tabung rx

•          +0,5 ml 1M asam sulfat,kocok,biarkan sesaat.

•          Pipet lap. atas yang jernih ke dlm tabung rx kecil.tabung 1 + prx Dragendorff; tabung 2 + prx Mayers.Rx positif jk endapan kuning jingga (orange) dengan Dragendorf; endapan putih dengan prx Mayer’s.

Catatan uji alkaloid

•          Pd rx pengendapan dengan prx logam berat seperti Mayer’s dpt terjadi kesalahan interpretasi karena protein jg positif

•          Diatasi dengan pe+ garam dapur (NaCl)

•          Senyawa lain: basa kuarterner dan amin oksida

•          Dilakukan seri prosedur ekstraksi: asam-basa-pelarut organik-air

•          Ekstrak air mgd senyawa basa kuarterner dan amin oksida

UJI ANTRAKINON

•          Kelompok zat warna atau pigmen alami dr kuinon alami

•          Zat warna atau purgatif misal: modin, rhein, chrysophanol

•          Cara:Serbuk (100mg) +KOH 0,5 N (2 ml) + hidrogen peroksida (3 tts) dididihkan 2’

•          Sth dingin disaring melalui kapas, Filtrat + asam asetat ad pH 5, + toluena (3 ml).

•          Lap.atas diambil dengan pipet,masukkan tabung reaksi + KOH 0,5 N. Warna merah pada lap.air (basa) berarti ada antrakinon

•          Bisa juga dg uji Borntrager (cari di Phytochemical Screening: Fong)

UJI POLIFENOL

•          Serbuk (500 mg) + air (5 ml) dipanaskan 10’ di tangas air mendidih.

•          Disaring panas, sth dingin + besi (III) klorida (3 tts), terjadinya warna hijau- biru sampai hitam ® adanya polifenol.

•          Uji diulang dg filtrat hasil pendidihan serbuk + etanol 80% (5 ml) 1’ dlm tangas air

UJI TANIN

•          Punya kemampuan utk menggumpalkan protein hewan pd proses penyamakan kulit

•          Sitotoksik, antikanker, dan antitumor

•          Cara: Serbuk (500 mg) +air (10 ml) dipanaskan 30’ diatas tangas air.

•          Disaring, filtrat + NaOH 2% (1 ml),bila terjadi endapan  disaring dg kertas saring. Filtrat + larutan gelatin 1% (2 ml). Endapan putih menunjukkan adanya tanin.

Uji Kardenolida (Glikosida jantung)

•          Serbuk (500 mg) + air (10 ml) dipanaskan 30’ diatas tangas air.

•          Disaring,filtrat + asam 3,5-dinitrobenzoat (0,4 ml) + KOH 1 N (0,6 ml) dlm metanol. Terjadinya warna biru-ungu menunjukkan adanya kardenolida.

•          Sbg penegasan filtrat 2 ml + kloroform 2 ml, lap.atas diambil dgn pipet, lap.bawah + asam 3,5-dinitrobenzoat (0,5 ml). Terjadinya warna biru-ungu ® kardenolida.

•          Beberapa uji kardenolida yg lain : uji Keller-Kiliani, Baljej,Legal,Kedde,Tolens,dll

Uji saponin (steroid dan triterpena)

•          Dicirikan dengan kemampuannya menghasilkan busa jika dikocok dengan air, haemolisis kuat pd sel darah merah,menurunkan tegangan permukaan dan racun ikan

•          Serbuk (100 mg) dlm tabung reaksi + air suling (10 ml),tutup dan kocok kuat-2 selama 30’.

•          Biarkan tabung dalam posisi tegak 30’.Apabila ada buih (sarang lebah) yg stabil > dr 30’ setinggi 3 cm diatas cairan menunjukkan adanya saponin.(uji Busa/buih)

•          Uji yg lain : Liebermann-Burchard (triterpena + steroid tak jenuh), uji Salkowski (steroid tak jenuh).

Glikosida

•          Gugus non gula (aglikon) + gugus gula (glikon)

•          Uji terhadap gugus gulanya dengan Prx Keller-Killiani

•          Cara : 10 g bahan + etanol 80%, saring, keringkan diatas penangas air.

•          Lemaknya dihilangkan dengan heksana sehingga tdk berwarna

•          Panaskan residu yang bebas lemak + 3 ml prx FeCl₃,aduk masukkan tabung rx.

•          Teteskan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding

•          Terbentuk warna merah kecoklatan yang bs berubah jd biru/lembayung (2 dioksi-gula)

Uji glikosida sianogen

•          Beberapa potong helai bahan uji yg masih segar ditempatkan dlm tabung rx +2 tts air dan toluena,dilumatkan dg batang pengaduk.

•          Tabung ditutup ketat dg gabus yg digantungi kertas pikrat.

•          Inkubasi 40 ^oC 2 jam.adanya HCN yg dibebaskan ditunjukkan dg perubahan warna kertas pikrat dari kuning jadi coklat kemerahan.

•          Jk rx negatif,tabung disimpan 2 hari utk diamati apakah HCN akan dibebaskan secara non-enzim

Uji Flavonoid

•          Merupakan zat warna fenolik dengan rangka karbon C₆-C₃-C₆

•          Aktivitas : antiviral,anti-fungal, anti-inflamasi, dan sitotoksik

•          Cara : 500 mg serbuk + 10 ml metanol 10’ diatas penangas air,saring selagi panas dg kertas saring. Filtrat diencerkan dg 10 ml air, pindah ke corong pisah + pe,kocok diamkan,pisahkan fase metanol,uapkan sp kering, residu + 5 ml etil asetat.

•          Ambil 1ml ,uapkan sp kering +1 ml etanol 95%, lalu + logam magnesium +10 tts HCl pekat. Jika terjadi warna merah ungu, berarti ada flavonoid, jika warna kuning jingga menunjukkan ada flavon, kalkon, auron. (Uji Shinoda)

•          Untuk antosian ®filtrat + HCl 1% didihkan warna sgt bervariasi antara merah orange sampai merah ungu

•          Leukoantosian ® + 0,5 ml HCl pekat  diamati warna yg tjd, dipanaskan 15’ diatas tangas air,bila perlahan2 tjd warna merah terang/ungu.(uji Bate-Smith dan Metcalf)

•          Katekin ® + FeCl₃ 2% dlm air,tp tdk spesifik

•          Uji kualitatif secara KLT

1. Skema pembuatan larutan percobaan untuk KLT

•          Keterangan

•          Larutan A : utk uji antrakinon,fenolat,flavonoid,kumarin,steroid

•          Larutan B : utk uji antrakinon,glikosida kumarin,saponin,tanin

•          Larutan C : utk uji kardenolid,saponin,flavonoid,antrakinon.

Sistem KLT yg digunakan:

•          Larutan A :

       Fase gerak : etilasetat-benzena (9:11)

                Fase dim    : Silika gel GF 254

                Deteksi      : FeCl₃,garam Fast blue B,vanilin-asam sulfat

•          Larutan B :

                Fase gerak  : etil asetat-metanol-air (100:13,5:10)v/v

                Fase diam   : Silika gel GF 254

                Deteksi       : FeCl₃,KOH etanolis

•          Larutan C :

                Fase gerak   : n-butanol-asam asetat-air (5:1:4)v/v fase atas

                Fase diam    : Silika gel GF 254

                Deteksi       : Liebermann Burchard,sitroborat

•          Skema ekstraksi alkaloid